检验项目 | 细菌内毒素试验（鲎试验）的全面解析

一、概念

一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是 革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、 金黄色葡萄球菌以及少数 革兰氏阴性菌。另一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

二、和热原的关系

热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。

热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。

热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。

三、来源和控制方法

1、细菌内毒素的特性

2、去除细菌内毒素的方法

• 吸附法 
  此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的 0.1%-0.5% ，将溶液加热到 70 ℃左右保温一定时间效果更好。使用的活性炭应符合药典规定要求。

• 蒸馏法 
  此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。

• 热破坏法 
  此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用 180 ℃干烤 3 小时，或 250 ℃干烤30min以上。

• 强酸强碱处理法 
  此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。

• 其他，也可以采用过滤等方法去除热原。

四、热原及内毒素检验法

1、家兔热原法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。

《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性 药物制剂。

2、鲎试剂法

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引起的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。

1956年 美国人Bang发现美洲鲎血液遇 革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量 革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了 鲎试剂检测法。由于 鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。

鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，鲎试剂法尚不能完全代替家兔法。

凝胶法、比浊法、显色法的原理图

3、凝胶法简介

最常用方法：细菌内毒素凝胶法简介

• 原理

• 常用英文缩写

BET：细菌内毒素检查  

BET水：细菌内毒素检查用水

MVD：供试品最大有效稀释倍数

NC：阴性对照

MVC：供试品最低有效浓度

PC：阳性对照

λ：鲎试剂灵敏度      

L：供试品细菌内毒素限值

• 仪器

• 电热恒温鼓风干燥箱

作用：干烤去热原

方式：250℃干烤30min以上。

注意事项：

从温度达到250℃开始计时。

干烤过程中不得开启干燥箱的门。

干烤物品不要叠放不要装载过满，以免影响空气流通。

设备须进行热穿透、热分布、内毒素挑战等项目的确认。

• 漩涡混合器

作用：混旋细菌内毒素

标准品，保证标准品溶液的浓度一致。

方式：

对冻干粉的细菌内毒素标准品复溶后，应混旋15min。

标准品梯度稀释过程中，每步稀释应混旋30s。

   漩涡混合后                 漩涡混合前

• 试管恒温仪：

作用：提供37℃恒温的环境。

方式：

对加入了内容物的鲎试剂分别放置于试管恒温仪中，37℃恒温60min±2min温育培养后，观察结果。

• 试剂

• 细菌内毒素标准品：工作标准品、国家标准品
• 鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。
• 细菌内毒素检查用水：含细菌内毒素的量极低：<0.015EU/ml ，不引入细菌内毒素，对内毒素试验无干扰作用。

• 内毒素检验的注意事项
  
• 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。
• 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。
• 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况下才能进行计算和判断。

内毒素的临床应用：内毒素血症 

内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起。内毒素血症分为内源性和外源性两大类。 

1、内毒素血症发生的原因 

在严重创伤、感染等应激状态下可出现： 

a) 全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力； 

b) 胃肠道粘膜缺血、坏死、屏障破坏，大量内毒素释放入血； 

c) 肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环； 

d) 某些组织、器官的感染引起外源性内毒素入血。 

2、内毒素血症的临床症状 

内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状以及休克等。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足，缺氧及酸中毒等。 

3、内毒素血症的后果 

内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。 

内毒素血症可引起一系列病理生理改变：①发热反应：内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢，或作用于白细胞使之释放内原性致热原；②促使血管活性物质如缓激肽、组胺、5-羟色胺、血管紧张素等释放，使血压下降，导致微循环障碍；③引起白细胞和血小板减少，激活凝血、纤溶系统，产生出血倾向；弥漫性血管内凝血；④经C3旁路或经典途径激活补体；⑤直接或间接损害肝脏，引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变；⑥激活白三烯、前列腺素、巨噬细胞、单核细胞及内皮细胞活性。 

4、各类疾病内毒素血症的发生率 

急性肝炎37-64%；爆发性肝炎58-100%；丙肝61.54%；胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%；烧伤85%；败血症70%；多器官功能衰竭100%；急性胰腺炎90%；皮肤软组织感染70-81.1%；腹腔感染72-84%；尿路感染70-80%（肾炎）、癌症70%；肺炎100%；上感100%。 

5、内毒素血症的治疗 

治疗原则多主张：①减少内毒素的产生和吸收；②改善内毒素引起的微循环障碍。 

6、内毒素血症-发烧病人败血症的早期预测 

革兰氏阴性菌败血症是住院病人死亡的重要原因。确切诊断要根据血培养结果，需花费几天时间。实验证明，无论是人和动物，革兰氏阴性菌败血症所许多症状是由内毒素血症造成的。内毒素可以激活单核巨噬细胞系统，通过IL-1、IL-6、IL-8、TNF等产生一系列毒性反应。内毒素是革兰氏阴性菌败血症的主要致病因素。用鲎实验法测定病人血中内毒素，可以预测发烧病人败血症发生率。 

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